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以Trizol说明书介绍的方法,将RNA和DNA的提取方法进行组合,同时提取RNA和DNA,RNA的纯度较高,可过1.9-2.0,而DNA的OD比值仅为1左右,请问各位有什么建议吗?以下是我的实验步骤,请各位指教。
1. 将培养板置于冰上,吸去培养液
2. 直接加入TRIZOL试剂(1ml/10cm2),反复吹打
3. 将细胞裂解液转移到新的1.5ml Ep管中,室温放置5min
4. 加氯仿(0.2ml/1mlTrizol),剧烈混匀15秒
5. 室温放置2-3min
6. 12000rpm离心,4℃,15分钟
7. 可见上层水相,中间混合相,下层酚相。
8. 吸取水相,转到2ml Ep管(水相=60%Trizol量),加异丙醇(0.5ml/1mlTRIZOL),颠倒混匀,室温放10min
9. 用无水乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA(0.3ml无水乙醇/1ml Trizol),反复颠倒混匀,室温放置3分钟
10. DNA管:4℃, 2400rpm, 离心5分钟
11. RNA管:12000rpm离心,4℃,10分钟
12. DNA管:移去上清,用含10%乙醇的0.1M柠檬酸钠洗涤DNA沉淀。每用1ml TRIzol加入1ml柠檬酸钠,室温放置30分钟并间歇性颠倒混匀
13. RNA管:吸去液体可见白色沉淀,加入75%乙醇1ml,剧烈混匀
14. RNA管:9000rpm,4℃,5分钟
15. RNA管:吸去液体,室温干燥5-10min
16. RNA管:溶于DEPC处理水中,约25µl,60℃,10分钟或4℃过夜
17. DNA管:4℃, 2400rpm, 离心5分钟,弃上清,重复一次。
18. DNA管:用75%乙醇再洗一遍DNA沉淀,每用1ml TRIzol加入1.5-2ml75%乙醇,室温放置15分钟(不时颠倒混合)
19. DNA管:4℃,2400rpm,离心5分钟, 弃上清。
20. DNA管:室温放置晾干DNA 5-15分钟
21. DNA管:用8mM NaOH溶解DNA,50µl(300-600μl/107细胞)。若有不溶物,可24000rpm,10分钟离心去除,取上清。
22. 取少量RNA,经紫外分光光度计测定光吸收值OD260和OD280,(OD260/OD280=1.8~2), RNA浓度(µg/ml)= OD260 × 40µg/ml × 稀释倍数,RNA总量(µg)=RNA浓度× 体积(ml)
23. 取少许DNA溶液,经紫外分光光度计测定光吸收值OD260和OD280(OD260/OD280=1.75~1.9),DNA浓度(µg/ml)= OD260 × 50µg/ml × 稀释倍数,DNA总量(µg)=DNA浓度× 体积(ml)
24. 取少量RNA,行1%琼脂糖凝胶电泳,染色,检测RNA完整性 |
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