发酵液中蔗糖的检测方法

金玉良缘

参考依据：GB/T 16265--2008   GB/T 5009.8-----2008
第一法：酶水解（酶电极法）

蔗糖的测定方法，一般采用盐酸水解法。由于盐酸水解蔗糖过程中，还有其他糖类被水解为还原糖，导致测定结果偏高。本标准采用的酶-比色法是在检索了近20年148篇国外文献的基础上，经过反复实验、验证而制定的。由于酶法具有高度的专一性(β-果糖苷酶只能催化蔗糖转化为葡萄糖和果糖)，灵敏度高，操作简便，因此测定结果准确。

1 范围
本标准规定了用酶电极法测定发酵液中蔗糖的方法，适用于各类发酵液中蔗糖的测定。
本标准最低检出限量为0.04μg(蔗糖)／mL(试液)。
2 原理
在β－果糖苷酶(β－FS)催化下，蔗糖被酶解为葡萄糖和果糖。葡萄糖氧化酶(GOD) 在有氧条件下，催化 β－D－葡萄糖(葡萄糖水溶液状态)氧化，生成D －葡萄糖酸－δ－内酯和过氧化氢。通过电极检测过氧化氢的含量从而计算出葡萄糖含量。仪器通过对已知浓度的标准品进行定标，标准品的电压值是衡量样本葡萄糖浓度的尺度。未知浓度可与标准品的电压信号相比较而获得。每次测定完毕后，系统缓冲液会自动清洗传感器电极，清洗完成后即可进行下一次测试。
      
                                    β－FS
C12H22O11 ＋ H2O     ────>        C6H12O6(G) ＋ C6H12O6(F)

                                 GOD
C6H12O6(G) ＋ O2 ────> C6H10O6 ＋ H2O2
由上述反应公式可知，一分子蔗糖水解产生一分子葡萄糖和一分子果糖，检测出葡萄糖的含量即为蔗糖含量。

3 试样的制备
3.1 按发酵罐无菌操作取样大约10毫升，取5ml放入离心管，离心除去菌体。’
3.2 用微量移液管取1.00mL上述离心上清液置于试管中，加入1.0mL β－果糖苷酶试剂溶液，摇匀，在36±1℃水浴锅中恒温20min。
3.3 按照葡萄糖酶电极分析仪操作说明标定电极。
3.4 取步骤3.2中的水解液500微升放入样品位，按照仪器操作说明进行测定。



第二法   酸水解

1　原理
　　样品经除去蛋白质后，其中蔗糖经盐酸水解转化为还原糖，蔗糖容易被酸水解，水解后产生等量的D-葡萄糖和D-果糖，再按还原糖测定。水解前后还原糖的差值为蔗糖含量。样本中所含的葡萄糖在固化的葡萄糖氧化酶的催化下发生酶解反应，反应产物为葡萄糖酸和过氧化氢。通过电极检测过氧化氢的含量从而计算出葡萄糖含量。仪器通过对已知浓度的标准品进行定标，标准品的电压值是衡量样本葡萄糖浓度的尺度。未知浓度可与标准品的电压信号相
比较而获得。每次测定完毕后，系统缓冲液会自动清洗传感器电极，清洗完成后即可进行下一次测试。
2　试剂  
　　2.1  6N盐酸：量取50ml盐酸加水稀释至100ml。
　　2.2　甲基红指示液：0.1%乙醇溶液。
　　2.3  20%氢氧化钠溶液。
　　其余试剂同GB 5009.8-2008《食品中蔗糖的测定方法》第9章。  
3　仪器
　　葡萄糖传感器，水浴锅
4 操作方法
　　4.1　按发酵罐无菌操作取样大约30毫升发酵液，放入离心管，离心除去菌体。
    4.2 酸水解
吸取2份5ml按4.1制备的样品处理液，置于50ml容量瓶中，一份加0.5ml盐酸（50ml盐酸缓慢加入50ml冷水中所制得的溶液），在68～70℃水浴中加热15min,冷后加2滴甲基红指示液，用20%氢氧化钠溶液中和至中性，加水至刻度，混匀。另一份直接加水稀释至50ml，
    4.3  按照葡萄糖传感器分析仪操作步骤标定仪器，分别取上述溶液500微升放入样品位，按照仪器检测步骤开始测样　　

5　计算
样品中还原糖的含量，以葡萄糖计，按照公式2进行计算，
X=Ax n  —————————————————————————————公式2
式中A为葡萄糖传感器葡萄糖读数，n为水解时试样的稀释倍数
　　试样中蔗糖含量的计算按照公式1进行技术
X =（R2-R1）x 0.95  —————————————————————————————公式1
　　式中：X--样品中蔗糖含量,%;  
　　R2--水解处理后葡萄糖分析仪测量值，含量%；
　　R1--不经水解处理葡萄糖分析仪测量值，含量，%;
　　0.95--还原糖（以葡萄糖计）换算为蔗糖的系数。

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