毕赤酵母表达的问题交流帖

lwdfjw

梦醒时分(6761760) 13:48:32
心如止水，什么问题？
心如止水(251436309) 13:50:33
我的基因转入毕赤酵母中表达不了
梦醒时分(6761760) 13:50:59
酶切鉴定过没有？
梦醒时分(6761760) 13:51:19
确定基因正确装入？
心如止水(251436309) 13:51:19
都做了，测序也是正确地
心如止水(251436309) 13:51:23
是的
梦醒时分(6761760) 13:51:30
信号肽正常？
心如止水(251436309) 13:51:45
是的

梦醒时分(6761760) 13:52:23
检查下基因里有没有提前终止子?
心如止水(251436309) 13:52:37
这东西我不会啊
梦醒时分(6761760) 13:52:56
找个会的呀
最简单的是换宿主菌
梦醒时分(6761760) 13:53:04
你用的是GS115？
心如止水(251436309) 13:53:41
是的实验室也就这菌
再就是大肠杆菌
梦醒时分(6761760) 13:54:14
换个X-33
梦醒时分(6761760) 13:54:31
要不换载体
梦醒时分(6761760) 13:55:06
你要是确定前期所做的工作都正确
只能这样替换排除了
心如止水(251436309) 13:55:18
我只有3.5K和9K的载体
把我的基因连到9K上后（一个是去了信号肽，一个是没有除去）经过测序后用Sall酶切转入GS115就是不表达
下面是我测序的结果
没有除信号肽
TTTtACGACACTTGAGAaGATCAAAAAACAACTAATTATTCGAAGGATCCAAACGATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTACGTAGAATTCATGTTGTTCAACTACCAATCCTTACTCGTGGGAGTCTCTCTGATCTCTCAAGCCCTGTCTGCACCTATTTTGGAGTCGAGGGCAACTGCTGACGCCGCTGCCTTCCCTGATCTGCACCGTGCAGCAAAGCTTTCTTCCGCTGCCTACACAGGTTGCATCGGAAAGGCCTTCGATGTCACTATCACCAAGAGGATTTATGACCTCGTGACCGACACCAATGGATTCGTCGGATACTCCACCGAGAAGAAGACCATCGCGGTCATCATGAGAGGCTCGACTACCATCACCGACTTCGTGAACGACATTGACATTGCTCTCATCACTCCTGAGCTCTCGGGCGTGACTTTCCCCTCTGATGTGAAGATCATGAGAGGTGTTCACAGACCTTGGTCCGCTGTACACGACACCATCATTACTGAAGTCAAGGCTCTCATTGCGAAGTACCCTGATTACACTCTGGAGGCAGTCGGACATTCCCTCGGTGGTGCCCTCACATCCATTGCCCACGTTGCCCTGGCCCAGAACTTCCCGGACAAGTCACTTGTCAGCAATGCCCTTAACGCCCTCCCCATCGGCAACCAAGCGTGGGCCGACTTTGGTACTGCGCAGGCCGGTACCTTCAACCGCGGAAATAACGTTCTTGACGGTGTCCCTAACATGTACTCGAGCCCGCTTGTTAACTTCAAGCACTATGGAACCGAATACTACAGCTCTGGTACCGAGGCTAGCACCGTGAAGTGCGAAGGCCAGCGTGACAAGTCTTGCTCTGCCGGCAATGGCATGTACGCTGTCACTCCCGGTCACATCGCAAGCTTTGGCGTCGTGATGCTTACTGCTGGTTGTGGCTATCTGAGCTGAGCGGCCGCGAATTAATTCGCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTtGGGCAC
除信号肽
aCTTTTACGACaACTTGAGAaGATCAAAAAACAACTAATTATTCGAAGGATCCAAACGATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTACGTAGAATTCGCACCTATTTTGGAGTCGAGGGCAACTGCTGACGCCGCTGCCTTCCCTGATCTGCACCGTGCAGCAAAGCTTTCTTCCGCTGCCTACACAGGTTGCATCGGAAAGGCCTTCGATGTCACTATCACCAAGAGGATTTATGACCTCGTGACCGACACCAATGGATTCGTCGGATACTCCACCGAGAAGAAGACCATCGCGGTCATCATGAGAGGCTCGACTACCATCACCGACTTCGTGAACGACATTGACATTGCTCTCATCACTCCTGAGCTCTCGGGCGTGACTTTCCCCTCTGATGTGAAGATCATGAGAGGTGTTCACAGACCTTGGTCCGCTGTACACGACACCATCATTACTGAAGTCAAGGCTCTCATTGCGAAGTACCCTGATTACACTCTGGAGGCAGTCGGACATTCCCTCGGTGGTGCCCTCACATCCATTGCCCACGTTGCCCTGGCCCAGAACTTCCCGGACAAGTCACTTGTCAGCAATGCCCTTAACGCCCTCCCCATCGGCAACCAAGCGTGGGCCGACTTTGGTACTGCGCAGGCCGGTACCTTCAATCGCGGAAATAACGTTCTTGACGGTGTCCCTAACATGTACTCGAGCCCGCTTGTTAACTTCAAGCACTATGGAACCGAATACTACAGCTCTGGTACCGAGGCTAGCACCGTGAAGTGCGAAGGCCAGCGTGACAAGTCTTGCTCTGCCGGCAATGGCATGTACGCTGTCACTCCCGGTCACATCGCAAGCTTTGGCGTCGTGATGCTTACTGCTGGTTGTGGCTATCTGAGCTGAGCGGCCGCGAATTAATTCGCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGACCGgTCT
梦醒时分(6761760) 13:55:25
一般情况下，换宿主菌就会有效果的
心如止水(251436309) 13:55:31
这是我的基因
心如止水(251436309) 13:55:44
做菌落PCR也成功了
梦醒时分(6761760) 13:55:57
是表达什么蛋白的？
心如止水(251436309) 13:56:13
碱性脂肪酶
梦醒时分(6761760) 13:56:14
还要看下是否是被降解了
梦醒时分(6761760) 13:56:35
酵母 本身有很多蛋白水解酶的
梦醒时分(6761760) 13:56:48
要注意下，添加下培养条件
心如止水(251436309) 13:57:40
这我就不晓得了

lwdfjw

梦醒时分(6761760) 13:59:04
我给你归纳下：
1）换宿主菌或载体
2）摸索下培养条件，主要考察下诱导的pH值

心如止水(251436309) 13:59:58
好的谢谢你
我 已经换了诱导的pH值
梦醒时分(6761760) 14:00:45
还是没表达？
心如止水(251436309) 14:00:54
你能帮我看看基因里有没有提前终止子吗？没有除信号肽
ATGTTGTTCAACTACCAATCCTTACTCGTGGGAGTCTCTCTGATCTCTCAAGCCCTGTCTGCACCTATTTTGGAGTCGAGGGCAACTGCTGACGCCGCTGCCTTCCCTGATCTGCACCGTGCAGCAAAGCTTTCTTCCGCTGCCTACACAGGTTGCATCGGAAAGGCCTTCGATGTCACTATCACCAAGAGGATTTATGACCTCGTGACCGACACCAATGGATTCGTCGGATACTCCACCGAGAAGAAGACCATCGCGGTCATCATGAGAGGCTCGACTACCATCACCGACTTCGTGAACGACATTGACATTGCTCTCATCACTCCTGAGCTCTCGGGCGTGACTTTCCCCTCTGATGTGAAGATCATGAGAGGTGTTCACAGACCTTGGTCCGCTGTACACGACACCATCATTACTGAAGTCAAGGCTCTCATTGCGAAGTACCCTGATTACACTCTGGAGGCAGTCGGACATTCCCTCGGTGGTGCCCTCACATCCATTGCCCACGTTGCCCTGGCCCAGAACTTCCCGGACAAGTCACTTGTCAGCAATGCCCTTAACGCCCTCCCCATCGGCAACCAAGCGTGGGCCGACTTTGGTACTGCGCAGGCCGGTACCTTCAACCGCGGAAATAACGTTCTTGACGGTGTCCCTAACATGTACTCGAGCCCGCTTGTTAACTTCAAGCACTATGGAACCGAATACTACAGCTCTGGTACCGAGGCTAGCACCGTGAAGTGCGAAGGCCAGCGTGACAAGTCTTGCTCTGCCGGCAATGGCATGTACGCTGTCACTCCCGGTCACATCGCAAGCTTTGGCGTCGTGATGCTTACTGCTGGTTGTGGCTATCTGAGCTGA
除信号肽
GCACCTATTTTGGAGTCGAGGGCAACTGCTGACGCCGCTGCCTTCCCTGATCTGCACCGTGCAGCAAAGCTTTCTTCCGCTGCCTACACAGGTTGCATCGGAAAGGCCTTCGATGTCACTATCACCAAGAGGATTTATGACCTCGTGACCGACACCAATGGATTCGTCGGATACTCCACCGAGAAGAAGACCATCGCGGTCATCATGAGAGGCTCGACTACCATCACCGACTTCGTGAACGACATTGACATTGCTCTCATCACTCCTGAGCTCTCGGGCGTGACTTTCCCCTCTGATGTGAAGATCATGAGAGGTGTTCACAGACCTTGGTCCGCTGTACACGACACCATCATTACTGAAGTCAAGGCTCTCATTGCGAAGTACCCTGATTACACTCTGGAGGCAGTCGGACATTCCCTCGGTGGTGCCCTCACATCCATTGCCCACGTTGCCCTGGCCCAGAACTTCCCGGACAAGTCACTTGTCAGCAATGCCCTTAACGCCCTCCCCATCGGCAACCAAGCGTGGGCCGACTTTGGTACTGCGCAGGCCGGTACCTTCAATCGCGGAAATAACGTTCTTGACGGTGTCCCTAACATGTACTCGAGCCCGCTTGTTAACTTCAAGCACTATGGAACCGAATACTACAGCTCTGGTACCGAGGCTAGCACCGTGAAGTGCGAAGGCCAGCGTGACAAGTCTTGCTCTGCCGGCAATGGCATGTACGCTGTCACTCCCGGTCACATCGCAAGCTTTGGCGTCGTGATGCTTACTGCTGGTTGTGGCTATCTGAGCTGA
梦醒时分(6761760) 14:01:02
用的是BMGY,BMMY？
心如止水(251436309) 14:01:26
先用BMGY再用BMMY
梦醒时分(6761760) 14:01:51
你再摸索下甲醇添加浓度
梦醒时分(6761760) 14:02:40
多尝试些条件
基因应该是你们优化过的，基本上不会出问题的
心如止水(251436309) 14:03:29
蛋白水解酶这个问题有解决的办法吗
心如止水(251436309) 14:03:58
好的谢谢你
梦醒时分(6761760) 14:04:00
有，添加一些有机氮源，如蛋白胨，酪蛋白等
心如止水(251436309) 14:04:10
好的
梦醒时分(6761760) 14:04:19
起到保护目的蛋白的作用

心如止水(251436309) 14:10:49
BMMY中不是有蛋白胨吗？