蛋白酶-食用

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1.工业应用
（1）蛋白质的改性。蛋白质在食品工业应用，除了营养因素外，更多是考虑到蛋白质的功能性质包括溶解性、乳化性、黏度、凝胶性、吸油性、吸水性等。
（2）多肽的生产。多肽产品广泛应用于药品、保健食品等产品中。
（3）水解蛋白的产生。水解蛋白包括动物水解蛋白和植物水解蛋白。过去水解蛋白主要是通过酸法制取，而酶法相比酸法，具有安全、条件温和、易于控制等优点。目前而言，动物水解蛋白已经主要通过酶法来生产，同时也有厂家通过酶法生产植物水解蛋白。
（4）蛋白质提取的应用。蛋白质经过浓缩提取，才能呈现更好的功能和营养性能，从而实现更好的市场价值。
2.酶法水解指标
平淡水解过程的指标和方法有许多，包括谁解读（DH）、提取率、三氯乙酸、溶解度、分子质量范围等。在水解过程中不存在单一的全能指标，如在蛋白质提取过程中一般主要评价蛋白质的得率；对于生物多肽的生产要考虑一定分子质量的肽类产品的比例等。
    提取率：提取率作为蛋白质水解过程中的宏观指标，一般针对蛋白质的提取过程而提出。
蛋白质提取率=（水解液蛋白质含量X水解液质量）/原料中蛋白质总量 X100%
质量提取率=（水解前原料质量-水解后残余原料质量）/水解前原料质量 X100%
    另外也可以用糖度（Brix）或折光率的变化来对水解过程进行粗略判断和控制。糖度值和折光度都是淀粉糖生产领域常用的一个指标。一般而言折光率和可溶性蛋白的量成正比，从而测定折光率或糖度的变化，就可以对该水解过程进行监控和判断。该指标适用于蛋白质的提取过程，折光率不再变化，就意味着水解过程已经临近与反应的终点。
水解度（DH)：谁解读是当前研究和生产中应用最多的一个指标，定义为：蛋白质水解反应过程中，被裂解的肽键占总蛋白质中总肽键的百分数。
水解度（DH)=水解液中游离氨基态氮的量/水解液中总氮的量 X100%
水解度（DH)=被水解的肽键数/肽键总数 X100%
水解度检测的主要原理为：检测水解液中实际游离氨基的量，同水解液完全水解得到的游离氨基的总量进行比较。其比值就为水解度的值。
水解均匀度：就是水解产物的分子质量分布情况。
水解均匀度的检测：当前可能的检测方法有HPLC方法、三氯乙酸溶解度方法、电泳方法、色谱柱分离方法、凝胶层析色谱法等。
3.解决酶解蛋白苦味问题
酶解蛋白苦味主要与蛋白中疏水氨基酸有关，在完整的蛋白质分子中，大部分疏水性氨基酸侧链隐藏在分子内部，不与味蕾接触，所以感觉不到苦味。在蛋白质水解过程中，疏水氨基酸暴露出来，就会呈苦味。蛋白中的疏水氨基酸含量越高，苦味越大。
对酶解蛋白的脱苦，目前主要有5种途径：
（1）类蛋白反应 指在一定条件下，采用蛋白酶催化蛋白质水解物或低聚肽混合物反应，生成一种不溶于水的弹性胶状蛋白类物质。在反应过程中，游离疏水氨基酸残基减少，苦味得以降低，这种方法还主要局限于实验室研究。
（2）遮掩 苹果酸、柠檬酸等一些有机酸、环状糊精、麦芽糊精、淀粉、果胶等可以遮掩苦味，都有不同程度的脱苦效果
（3）选择性分离 苦味肽相对于其他多肽成分，含有较高的疏水基团，利用这种特性可以对枯萎太进行选择性分离。所采用的手段包括：吸附剂吸附、有机溶剂萃取、等电点沉淀、色谱分离等。目前工业上主要采用活性炭吸附方法，采用这种方法虽然对苦味具有很大改善功效，但也会大幅度降低酶蛋白得率，所以一般在一些高附加值产品中使用。
（4）酶解条件的选择 一方面，酶制剂的选择，特别是一些外切蛋白酶（氨肽酶、羧肽酶）对酶解蛋白进行处理。另外，研究和实践表明，因为在碱性蛋白酶的作用下产生更多的疏水性氨基酸端，所以碱性蛋白酶的水解产物苦味最大；而真菌蛋白酶现对其他酶，水解产物苦味较小。目前在实践中，采用外切酶的脱苦方法最为行间，但这种方法使用不当也会造成产品中氨基酸比例过高，因此一些应用中的需要对水解均匀度进行控制。
控制水解度也是工业上常用的控制苦味的方法，蛋白质的水解都和水解产物的苦味存在着密切的关系，水解度较低时，肽链较长，许多疏水性氨基酸还没有完全暴露，苦味较弱；随着水解度进一步增加，疏水性氨基酸暴露程度增加，苦味增加；水解度进一步增加时，苦味肽被水解为更小的肽或者氨基酸，苦味就会减弱或者消失。有资料介绍，DH在10%~15%时，对苦味的影响不大，而DH大于15%时，蛋白质水解物的苦味将急剧增加。所以需要在酶解过程中严格控制水解度的变化，在酶解结束后，立即采取有效措施将蛋白质灭活，防止蛋白质继续过度水解，尽量降低蛋白质水解物的苦味产生。
（5）微生物脱苦 许多微生物都能产生肽酶，利用微生物脱苦的原理和利用外切蛋白酶进行脱苦的原理类似。利用微生物脱苦具有价廉的优点，但微生物脱苦也不免会子蛋白质底物中带入新的杂志。目前，研究具有脱苦效果的微生物包括米曲霉、黑曲霉、酵母、乳酸菌等。
4.蛋白酶解过程中技术要点
（1）原料的预处理
释放蛋白，保证蛋白酶和蛋白质充分接触：蛋白酶只有与蛋白质接触再能发挥作用。
蛋白质的变性处理，对于天然蛋白，蛋白质分子呈现紧密、有规则的空间构型。蛋白酶的水解作用需要具有合适的位点，所谓蛋白酶对天然蛋白的水解效率很低，甚至不能水解，如蛋白酶对胶原蛋白的水解等。对蛋白进行预处理，使其规则结构解体，更多的内部基团暴露出来，将会有效提高水解效率。蛋白质变性手段有很多，最常用的就是热处理工艺。蛋白不同，所需的温度也不同，温度过高会引起蛋白的交联聚集，形成蛋白酶难以作用的大分子聚合物。
（2）酶的处理
卫生指标要求，蛋白酶分为医药级、食品级、工业级。
酶解效率、特点的选择：不同蛋白酶作用的位点不同，选择性也不同，水解效率差异大。
杂酶的影响：对于工业化酶制剂产品，酶制剂往往是混合产品，除含有一些杂质外，还会含有其他酶系，如淀粉酶、脂肪酶等。一定条件下杂酶的应用有助于酶的水解，提高水解效率，但是在蛋白质的提取应用中杂酶的存在往往会带来一些不利因素。在对蛋白质的水解提取的同时，杂酶也会对一些不需要的成分，如纤维、脂肪等进行作用，从而导致杂质含量提高，最终产品的纯度也会受到影响。
（3）水解条件的选择 影响蛋白酶发挥作用的条件包括pH、温度、加酶量、底物浓度、搅拌等。
（4）水解方式的选择 对于单一酶种，加酶方式分为一次加酶、多次加酶，一般多次加酶程序复杂，但可以减少蛋白酶的用量，一般适用于酶价格较高、酶加量较大的酶解条件。
对于蛋白酶的复合应用，还可以分为一次加酶、分布加酶；利用分布加酶，可以针对不同蛋白酶的特性改变相应的反应条件，并且与一次加酶的水解效果也有差异，包括水解度、分子质量分布等。另外，对于分步加酶，不同的加酶顺序对于水解产物的效果，如分子质量范围等也会产生不同的影响。

1酶技术对大豆蛋白进行改性处理
（1）注射型分离蛋白 产品用于整块肉制品的注射用盐渍液中，可以减少肉制品的蒸煮损耗，提高肉制品的弹性和切面质量。由于产品通常添加量比较小，在3%一下，所以对苦味可以不做严格控制。该类产品要求具有较低的黏度，同时，要求控制起泡性的升高和凝胶性的减弱。
起泡性和凝胶性是大豆蛋白的两个重要性能。起泡性主要由分子表面亲水基团和疏水基团的比例决定。初始时，蛋白质分子具有完整的结构，在水溶液中，分子表面为亲水集团，疏水基团被包被在分子中心，所以起泡性能比较低，用蛋白酶对大豆蛋白进行水解，随着蛋白质的水解，疏水基团就会暴露出来，起泡性会随之增加。大豆蛋白具有热凝胶性能，在一定pH、浓度条件下，对大豆蛋白进行加热处理，大豆蛋白中的蛋白分子进行解聚，形成线装大分子结构，疏水基暴露出来；冷却后疏水基团相互作用，形成网状结构。分离蛋白的热凝胶性能随着水解度的提高而持续降低。分析蛋白保持一定的凝胶性，可以提高最终肉制品的弹性和切片质量，降低其蒸煮损耗。
（2）乳制品用分离蛋白 用蛋白酶对分离蛋白进行水解，一方面，可以使其溶解性、黏度等性能符合乳制品、固体饮料类的产品要求。另一方面，酶解分离蛋白具有更高的营养价值。出消化率升高外，外具有抗氧化、清除体内自由基功能。
用酶法生产乳制品分离蛋白，一方面要提高溶解度，控制黏度降低；另一方面要控制苦味的产生。一般控制酶解水解度在10~20%。另外，对于固体饮料用分离蛋白产品，产品还要求具有良好的冲调性能，需要对蛋白进行速溶化处理，如表面喷涂磷脂、附聚造粒等。
（3）其他功能型分离蛋白产品 分离蛋白在食品中的广泛应用，主要在于其良好的功能性能。在酶解过程中，分离蛋白的功能特性，如溶解性、黏度、起泡性、乳化性、凝胶性、持水性、持油性都会产生变化。上面介绍的两种分离蛋白进行有限酶解，选择不同的酶种类，采用不同的酶解条件，也可以开发其他不同功能性的产品，如酸溶性分离蛋白、高起泡型分离蛋白、高乳化型分离蛋白等。
以大豆分离蛋白为原料可以生产大豆多肽。
大豆分离蛋白→酶解→分离→精制→干燥→大豆多肽产品
2生产米糠蛋白
酶法制取米糠蛋白主要有：
（1）非淀粉多糖酶（NSPE）和植酸酶   
（2）蛋白酶：碱性蛋白酶>中性蛋白酶>酸性蛋白酶。但是碱性蛋白酶的作用会产生更多的疏水基从而苦味更明显，需要进一步利用外肽酶等对其进行处理；随着水解程度提高，提取率上升但水解度过高，严格意义上，得到的产品是米糠的小分子蛋白和肽的混合物，产品的功能性和应用将会受到局限。所以，为保持米糠蛋白一定的功能性能，一般要控制合适的水解度。
（3）淀粉酶：米糠中含有部分的淀粉类碳水化合物，用淀粉酶对其进行处理，使其水解为可溶性的糊精或小分子糖。对去除这些组分，可以提高后续最终产物的蛋白质含量和膳食纤维的纯度；除去杂质作用外，对淀粉类物质进行水解，也有利于蛋白质的溶出。
目前出现问题：开发难度和成本控制；产品功能性能；应用市场的问题
3生产酵母提取物
    酵母提取物是以面包酵母、啤酒酵母或葡萄酒酵母为原料，采用自溶或加酶水解工艺，经分离、脱色制成的，含氨基酸、肽、多肽及酵母水溶性成分的产品。
酵母提取物的原料为面包酵母、啤酒酵母、葡萄酒酵母等。我国主要以面包酵母为原料。
酵母提取物的生产方法主要有4种：自溶法、外加酶水解法、酸水解法、机械磨碎法。其中，工业上主要采用前两种方法。
    自溶法：利用酵母本身含有的蛋白酶系、碳水化合物系、核酸酶系等将酵母体内的糖类物质、蛋白质和核酸等分解为氨基酸、肽类、核苷酸、小分子糖等小分子物质并将其从酵母细胞内抽提出来的一种方法。酵母在自溶过程中，由于其自身酶系的酶活力有限，并且随着自溶的进行，酶活力不断降低；酵母自溶过程周期长，容易引起杂菌繁殖。因此，一般在酵母抽提物的生产过程中，需要外加一定量的蛋白酶或核酸酶来加速酵母的自溶。
预处理破壁处理自溶步骤④灭酶


图1.酵母提取物-自溶法
4生产植物水解蛋白
    植物水解蛋白是对植物蛋白质原料，如大豆粕、棉籽粕、谷朊粉等进行酸姐或酶解的到的一类植物蛋白水解产品，其具有一定的呈味性能，作为调味基料用于调味品加工领域。植物水解蛋白在欧美被称为HVP（hydrolyzed vegetable proteins）。生产HVP的方法有2种酶法和酸法。
酶法生产HVP条件温和，蛋白质被水解为多肽和氨基酸等物质，产品具有很高的营养价值和功能特性；另外，氨基酸不被破坏，构型不发生改变，水解度易于控制，这些优势都决定了酶法生产时未来植物水解蛋白发展的方向。
酶法存在问题：水解度低呈味反应程度不够水解度低，苦味问题突出
5动物水解蛋白
动物水解蛋白（hydrolyzed animal proteins，HAP）是指在酸或酶的作用下，对富含蛋白质的动物组织进行水解得到的水解产物。动物水解蛋白所用的原料一般是肉加工长废弃的下脚料、低值鱼类、水产加工长的废料和低值产品等。
HAP可以用来生产保健食品和药品，用于老年人消化功能衰退的治疗、手术患者的辅助康复治疗等。此外，HAP也是生产肉味香精的重要基料，它含有大量的氨基酸和小肽等组分，具有原料固有的肉类风味；对比HVP，其呈味能力更为突出。由于价格较高，HAP目前主要用于一些高档调味品中。HAP的呈味机制比较复杂，除呈味氨基酸、小分子肽、核苷酸的作用外，还有还原糖和氨基酸之间的美拉德反应、脱酰胺作用、脱羧基作用、脂肪降解等各种反应的综合作用，这些作用共同构成HAP的浓郁香味。动物原料本身的呈味能力高于HVP，所以一般苦味问题没有HVP明显。目前工业上，HAP以酶法生产为主。

图2.HAP
6低值杂鱼酶法制取水解鱼肉蛋白
水解鱼肉蛋白一方面可以用作幼稚的天然调味基料，用于高档符合调味香精香料的生产，另一方面，水解鱼肉蛋白具有很高的营养价值，可以用作食品营养强化剂，也可以用做良好的疗效食品原料，用于一些手术后患者、高血压患者的辅助治疗。
基本工艺流程为：
低值鱼→粉碎→加水调浆→酶解→过滤→离心脱脂→脱腥脱苦处理→浓缩→干燥→成品
7在明胶工艺中应用
明胶是以动物的胶原结缔组织和皮革为原料，经一系列提取过程生产出来的胶原蛋白。明胶来源于胶原的不溶性蛋白，是胶原部分降解变性的产物。明胶易溶于热水，不溶于冷水，随着温度的升高或降低具有溶胶和凝胶的可逆转化的优良特性，干燥后的明胶图层呈透明状。目前明胶产品主要应用于照相感光工业、医药工业、食品工业以及其他领域中。
根据原料来源不同，明胶可以分为骨明胶和皮明胶；按照加工工艺不同可以分为酸法明胶（A型胶)和、酶法明胶（B型胶）和酶明胶。酶制剂在明胶工艺中的应用主要有两方面，一是酶制剂用在明胶的提取程序中；二是利用酶制剂对明胶进行改性，用在生产低分子质量的水解明胶或其他类型的改性明胶。
（1）酶制剂在明胶提取程序中的应用：目前明胶提取中的酶制剂主要是脂肪酶和蛋白酶等，脂肪酶主要用在原料的预处理阶段，用于只当成分的去除；蛋白酶用于末端链的降解和杂蛋白的去除。其应用包括明胶原料的预处理阶段和明胶的提取的阶段。
（2）酶法对明胶的改性：酶法改性生产水解明胶。转谷氨酰胺酶应用于明8酶法
9生产硫酸软骨素
硫酸软骨素是广泛存在于人和动物软骨组织中的一种黏多糖。其来源包括猪、牛、羊、等动物的鼻骨、喉骨、关节骨、及禽类和水产品的软骨组织等。硫酸软骨素具有调节机体免疫、预防细菌或病毒感染、抗凝血、抗血栓、激活脂蛋白酶、调节机体脂类代谢和保持血管壁弹性等生物活性。
硫酸软骨素的生产方法有碱法（稀碱法和浓碱法）、酶法、碱酶法、碱盐法、中性盐法等。目前工业上采用的就是酶法生产硫酸软骨素。
10在饲料加工行业：
分解饲料中大分子蛋白质称为可以被动物直接吸收的小分子肽以及氨基酸等，促进动物对饲料营养成分的吸收。通常情况下，饲料加工中使用的都是复合酶，蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶、纤维素酶等共同作用，能有有效帮助畜禽类生长吸收。
11在洗涤用品行业：
在洗涤用品行业中，主要使用的是碱性蛋白酶。碱性蛋白酶的一个重要参数是等电点(PI)，适用于洗涤剂的碱性蛋白酶PI与洗涤液pH值保持一致。通常用来去除污渍如血渍和草渍等，将附着在织物上或者硬表面的蛋白质被降解呈小片段，然后这些小片段能够被洗涤剂的其他组分溶解或者去除。对于一些食物污渍如可可汁等，一些蛋白酶和淀粉酶或者脂肪酶联用去除效果更好。
12啤酒加工行业：
在糖化和发酵的同步工艺中使用蛋白酶，可以分解谷物中的蛋白质，增强酵母营养，促进酵母生长和发酵，从而有利于缩短发酵时间，提高原料的出酒率。因为蛋白酶将以自由氨基氮的形式释放养分，发酵浆中的微生物群，如果在它们形成时没有被存在的酵母培养液同化的话，也可以利用这些养分。
13制革加工行业：
原料皮的95%是蛋白质，其中纤维蛋白胶原约占93%，是制革的有用部分，制革工艺的前处理是浸渍、脱脂、脱毛、和软化，将原料皮的残肉、脂肪、毛和胶原间隙蛋白去除，这些前处理都需要使用烧碱和硫化钠等化工原料，造成对环境的严格污染。蛋白酶不作用胶原，而只能水解角蛋白、弹性蛋白和球蛋白等杂质，浸水时刻促进皮子吸收，脱毛时可分解毛皮于表皮间连接的类粘蛋白，使胶原纤维松散，使鞣制后的皮革柔软。