大肠发酵过程菌体自溶现象与分析

gl19860312

大肠杆菌发酵过程经常会发生各种各样的菌体自溶，可以发生在分批阶段，补料阶段，诱导后阶段。每个阶段有不同的原因和对策，下面我会分批次说说各种自溶的原因以及对策，希望有抛砖引玉之效。
首先，我说说分批阶段。在分批阶段，通常自溶可以发生在几乎任何阶段，比较早的可能是接种后菌体生长过慢延滞期大大增加从数小时至十数小时，晚的大致出现在补料前。早期自溶可能出现的现象：延滞期增加，溶氧pH变化可能不大（也有上升至某一点不动）泡沫少或者几乎无泡沫；中晚期的表现大致可以有泡沫形成（停止搅拌后泡沫经久不散），加入消泡剂无效，pH上升，溶氧上升，镜检可见碎片，发酵液味道异常等现象。
分批阶段自溶的原因：菌种，培养基，噬菌体，工艺异常，人为失误等。以下贴子将一一分析。

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分批阶段自溶。菌种
菌种是发酵过程的关键，没有好的种子等于无米之炊。这里说的菌种包括种子库和一级二级种子。如果出现自溶，首先要排除掉菌种的原因，否则可能会连累整个种子库。菌种出问题，有可能是菌种老化和菌种带杂菌或者噬菌体。
如果是单纯的菌种老化，可能会造成质粒脱落进而丧失抗性造成菌体自溶；可能造成抗噬菌体能力下降以致噬菌体侵入造成菌体自溶；
杂菌污染：杂菌生成的毒素等物质造成大肠死亡。
噬菌体：噬菌体有F+噬菌体与体噬菌体，烈性噬菌体和温和噬菌体之分。烈性噬菌体可在吸附后20-30分使菌体裂解；温和噬菌体也会在一定条件下释放造成菌体裂解。噬菌体是造成大肠杆菌自溶的一个非常重要的因素，下面会详细叙述。
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为了防止菌种培养过程中万无一失，需要做的
1 严格的菌种培养环境与菌种保藏环境，做到废液及时灭菌，不给噬菌体杂菌以传染的机会。
2购进的菌株或宿主必须首先进行噬菌体监测。
3严格的实验操作，操作台要整洁有序；甘油等储存液体即灭即用，做好传代记录以备查询。
4菌液培养过程中注意菌体的生长阶段，以对数生长期为佳。注意菌种的传代次数，防止传代过多造成质粒丢失或其他特性的丢失。
5合适的保藏方法。
6可以通过分离纯化等方法使菌种复壮。

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分批阶段自溶。噬菌体
关于噬菌体的相关文章非常多，但是对于工程菌噬菌体的相关文章相对较少。分批阶段的噬菌体污染可能来源：菌种带毒；接种（包括摇瓶试管等）带入；压缩空气进入等。归纳起来无非是菌种带毒与环境污染。
噬菌体（bacteriophage）是一类侵害细菌（包括放线菌）的病毒，又称细菌病毒（bacterialvirus）。具有其他病毒的共同特性：个体小、可通过除菌滤器、没有细胞结构、非常专一的寄生性等，为非细胞生物。其结构主要由蛋白质和核酸（DNA或RNA）组成。在自然界中分布广泛，土壤、空气、水中或生物体内都可存在。据噬菌体与寄主细胞的关系可分为烈性噬菌体（virulent phage）和温和噬菌体（temperate phage）两类。前者改变寄主的性质，大量产生新的噬菌体，最后导致菌体裂解死亡；后者可因生长条件的不同，即可引起寄主细胞的裂解死亡，又可将其核酸整合到细菌的染色体上，使细菌细胞继续生长繁殖，并被溶原化。
　　噬菌体的危害主要存在于发酵工业，如乳制品、酶制剂、氨基酸、有机溶剂、抗生素、微生物农药和菌肥生产等。由于它的个体比细菌小数百倍，可以附着于尘埃上随风飘移，因此能长久地扩散和传播到一定的范围，并能脱离寄主而存活。它在寄主细胞内能大量迅速繁殖子代噬菌体，如在十几分钟至一个小时左右，一个细胞感染一个噬菌体后可以释放出数十个至数百个子代噬菌体。一旦发生噬菌体污染，会导致发酵异常、倒罐，使工业生产遭到严重损失。
　　由于噬菌体的结构比细菌和高等细胞简单，故广泛用于复制、转录和调节机理的研究。
λ噬菌体以原噬菌体方式存在于大肠杆菌K12株系中，利用紫外线诱导可以释放λ噬菌体，可感染已经丧失了λ噬菌体的大肠杆菌株系。λ噬菌体在大肠杆菌中可裂解生长或整合到寄主染色体中复制。λ-DNA可在体外包装成病毒颗粒，高效地感染大肠杆菌；可以把25kb长的外源DNA插入λ-DNA，引入受体细胞；另外重组λ-DNA的筛选和保藏较易，故常作为分子克隆的载体。
噬菌体具有非常专一的寄生性，它只能在特异的寄主细胞中增殖。另外，噬菌体缺乏独立代谢的酶体系，不能脱离寄主而自行繁殖。因而噬菌体的繁殖必须依赖于寄主细胞的繁殖，它只能在活的、正在繁殖阶段的细胞中繁殖；而在死的、衰老的、处于休眠状态的细胞中，或在代谢产物或培养基上均不能繁殖。
当烈性噬菌体侵染细菌后会迅速引起敏感细菌裂解，释放出大量子代噬菌体，然后它们再扩散和侵染周围细胞，最终使含有敏感菌的悬液由混浊逐渐变清，或在含有敏感细菌的平板上出现肉眼可见的空斑──噬菌斑。
噬菌体的生长和繁殖过程包括五个步骤，即吸附（adsorption）、侵入（injection）、增殖（replication）、成熟（maturity）和释放（release）。
（一）吸附
　　吸附是噬菌体的吸附器官（尾丝、基板和刺突）与敏感寄主细胞的特殊位点的接触。尾丝首先触及寄主细胞表面，然后基板和刺突固定。一般说，噬菌体对寄主要求专一性很强，比如，产谷氨酸的北京棒杆菌噬菌体就严格地限于侵染北京棒杆菌。但也有些噬菌体也可以感染相近的种或属的菌株，如四环素生产菌的噬菌体。敏感的细胞并非整个细胞各处皆可吸附，须在特殊位点，而且大肠杆菌的受点还依噬菌体而异。T3、T4和T7噬菌体的特殊位点是脂多糖层；T2和T6是脂蛋白质，雄性专一噬菌体是F+细胞的纤毛。当然，噬菌体吸附的寄主细胞和特殊位点的专一性并非一致，程度有差异。
二）侵入
　　吸附后，尾丝收缩，感染过程开始，对T类噬菌体就开始收缩尾鞘，结果不仅尾髓插入细胞壁，而且会像注射一样将DNA打入细胞内。蛋白质的外壳仍在壁外，而线状噬菌体fd则全部进入寄主细胞。从吸附到侵入时间很短，如T4仅需15s
（三）增殖
　　噬菌体一侵入，增殖即开始，即核酸的复制和蛋白质的合成。先利用寄主的RNA聚合酶转录，噬菌体的mRNA被寄主的蛋白质合成体系翻译，形成一系列新的早期蛋白质。在T类噬菌体中，早期蛋白质包括一种新的DNA聚合酶，分解寄主的DNA的核酸酶，合成5-羟甲基胞嘧啶和它的ATP所必需的酶，以及转录形成后期蛋白质基因所需的蛋白质。然后开始噬菌体核酸的复制。在含有双股DNA的噬菌体中，复制过程与一般DNA复制相似。在含单股DNA的噬菌体如ΦX174中，一条互补的DNA被合成，形成了双股DNA，接着再以此作模板合成RNA和子代DNA。第二步是后期蛋白质开始出现。在T类噬菌体中，合成的后期蛋白质是噬菌体头和尾成分的亚单位，还有噬菌体的溶菌酶。这种酶能分解寄主细胞壁的肽聚糖。
（四）成熟
　　当所有噬菌体结构成分都已合成时，成熟过程（即“装配”）便开始。在T4中，装配一个成熟噬菌体约需30种不同的蛋白质，而且至少具有47种基因功能。其过程先是DNA的凝聚，头的亚单位被组装成头部，尾和尾丝也各自组成。然后按从头至尾的顺序自我装配，最后将尾丝装上，形成一个完整的噬菌体
五）释放
　　噬菌体繁殖的最后阶段是裂解释放出子代噬菌体。裂解T类噬菌体感染的细胞要涉及两个或更多基因的作用，至少一个作用于细胞膜，另一个具有溶菌酶的作用将分解壁的肽聚糖，线状噬菌体则不裂解寄主细胞，可能是通过挤压而冲出细胞壁。
　　每种噬菌体侵入敏感细胞，每个细胞最后能装配完成和释放出的噬菌体数称为裂解量，它是相对固定的。如T4为100，ΦX174为1000，f2为10000，T2为200；谷氨酸产生菌的噬菌体为50～150。
　　噬菌体一步生长曲线，这是定量描述烈性噬菌体生长规律的实验曲线。实验时必须用噬菌体去感染高浓度的寄主细胞，以保证每个细胞所吸附的噬菌体至多只有一个。由于众多寄主细胞的裂解不可能同步，所以释放期较长。
噬菌体效价的测定
　　效价（titre）在这里的含义是表示每毫升试样中所含具有感染性噬菌体的数量，也称噬菌斑形成量（plaque-forming unit）。
　　测定效价的方法常用双层平皿法。在已倒2％琼脂下层的平皿上，将1％琼脂上层培养基与敏感寄主细胞和噬菌体试样稀释液混匀凝固后，37℃培养10多个小时，平皿表面会形成具有一定形状、大小和透明度的噬菌斑。由于一个噬菌体先侵染一个细胞，然后以此为起点再反复侵染周围大量细胞，结果形成可观察到的一个噬菌斑。据知一个直径2mm的噬菌斑含有107～109个噬菌体。
噬菌体有两类，大多数噬菌体是烈性的，如T4、T7、ΦX174等，它们在生长循环结束时就杀死细胞，其过程就像整个生长繁殖过程。不过，在自然界还存在另一种噬菌体，称为温和性噬菌体。
　　温和性噬菌体感染一个敏感细菌菌株时，根据各种遗传和生理条件，有两种可能的行为，即一些细胞被噬菌体增殖所裂解，而另一些则被溶原化。
　　温和性噬菌体侵入寄主细胞后，由于前者的基因组整合到后者的DNA上，并随寄主细胞的复制而进行同步复制，不引起寄主细胞裂解的现象称“溶原化”。能引起溶原化的噬菌体即称温和性噬菌体，已整合到寄主DNA上的噬菌体就称“原噬菌体”，这时的寄主就称“溶原菌”（lysogenic bacteria）。以“原噬菌体”的方式嵌存于寄主的DNA中，可随寄主繁殖，延续传代，“和平共处”，一般不引起细胞裂解。产生溶原化的菌株的命名方法是，在菌株名称后加上括号，括号内是它们所携带的原噬菌体的名称。如E．coli（λ），λ即为大肠杆菌菌株携带的原噬菌体
像菌株的其他遗传特性一样，溶原性通常也是菌株的一种非常稳定的特性。因此在大多数溶原细菌细胞群体中，只有极少数溶原菌会丢失它们的噬菌体，失去的原因尚不很清楚。溶原性细胞经诱导也可变成“烈性”状态，即也可复制和溶解寄主细胞并释放出正常的有感染力的噬菌体。另外，溶原菌对于同一种噬菌体或是与之密切相关的噬菌体表现出免疫性，即它不能再被同一种噬菌体所裂解或溶原化。但免疫性不同于细菌对噬菌体的抗性，抗性是由于细胞表面受体部位结构的改变而使得噬菌体不能吸附。
　　溶原性细菌易识别，只要把溶原细菌在固体培养基上划线，当划过一个对噬菌体敏感的菌株时，沿着溶原性细菌的边界处可以看到一个窄的裂解区。当溶原性细菌被强烈因素处理时，也易于转变为烈性。此外，许多菌株可被几个不同的噬菌体溶原化
噬菌体具有非常专一的寄生性，它只能在特异的寄主细胞中增殖。另外，噬菌体缺乏独立代谢的酶体系，不能脱离寄主而自行繁殖。因而噬菌体的繁殖必须依赖于寄主细胞的繁殖，它只能在活的、正在繁殖阶段的细胞中繁殖；而在死的、衰老的、处于休眠状态的细胞中，或在代谢产物或培养基上均不能繁殖。为此，必须采用特殊的方法对噬菌体进行分离检查。
（一）分离方法
1．分离样品的制备
1）分离源为液体时，可进行一次离心分离，即在10000r／min的转速下分离10min，除去杂菌，用上清液作为分离样品。
2）对于土壤等固体材料，可先取1～2g固体悬浮于5～10mL培养基内，然后取离心上清液为样品。
3）以溶原菌的培养液作为样品时，考虑到诱导噬菌体的产生，可用紫外线或丝裂霉素C处理后，再进行培养。
4）要从设备或容器的表面分离噬菌体，可先用灭菌棉签用力地擦拭容器的表面，然后将棉签放入2～3ml培养基充分洗脱。以此液体作为分离样品。
5）由空气中分离噬菌体时，可用真空泵抽引，使空气进入培养基内，此经捕集的培养基即可作为分离样品，而在噬菌体密度高的位点，只要将长了寄主菌的平皿打开，在空气中暴露30～60min即可。
　　经制备后的样品中噬菌体含量太少时，可将样品放在寄主菌液内培养适当时间，使噬菌体繁殖。为避免杂菌增殖，可加入过滤的样品或采用抗链霉素的寄主菌，在加链霉素的情况下进行培养。有两种以上噬菌体存在时，培养时间短，以免增殖速度慢的噬菌体为增殖快的噬菌体所压倒。当然，也可用膜滤器浓缩。
2．寄主细胞的培养
　　在分离噬菌体时，可采用能使噬菌体增殖到一般程度的培养基。若菌的生长过于旺盛，有时反而不会形成噬菌斑。因为有的噬菌体的吸附和增殖要求有特殊的物质，所以最好用含蛋白胨、酵母膏等的半合成培养基，并在其中补加10－３mol／L的Ca2+和10－２mol／L的Mg2+。当难以做出选择时，可先用补加Ca2+的无糖肉汁培养基试试。
3．分离方法
　　预先分别配制含2％和1％琼脂的下层培养基和上层培养基，在固化下层琼脂培养基的平皿中将融化的上层软琼脂培养基与寄主细胞混合，并使其布满平皿，然后用接种环、毛细管或微量吸管取样品在培养皿上点12～25个点，待液体被培养基吸收后培养过夜，检查点样部位有无噬菌斑出现。噬菌体少时，噬菌斑集中；有时噬菌体量太多，看不到噬菌斑，尤其是那些取自溶原菌的样品。此时可同时检查原液和稀释液，就不至于造成这种情况。也可不用改变稀释度的方法进行检查，而是以接种环取样品原液点在涂有菌的平皿的一角上，然后进行连续弯曲的划线。样品数量特别多时，可将几个样品混合后进行检查，然后舍弃阴性试样。
　　由溶原菌分离噬菌体可用大型接种环取敏感菌的菌悬液在平皿上划两条线，然后将待试的噬菌体的悬浮液与一条直线交叉划八字横线，经适当剂量的紫外线照射后进行培养，检查交叉处有无噬菌斑出现。

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（二）噬菌体的纯化和噬菌斑的形状
　　用接种针挑取单个的噬菌斑，将黏着的噬菌体悬浮在1mL培养基内，经适当稀释后，再使之重新形成噬菌斑。再反复进行此操作，直至证实其为纯的噬菌体为止。
噬菌斑的大小不等。有的小如针尖，一般称为针孔状噬菌体，有的直径达10～15mm，即使是同一种噬菌体，其噬菌斑大小也会因培养基组成和pH值、软琼脂培养基数量和琼脂浓度、菌龄和菌数、平板培养温度和时间等条件的不同而异。即使在同一条件下，其大小也往往不同。
　　总之，在分离噬菌体时，必须注意观察噬菌斑的形状。如按照上述方法，使形状、大小不同的噬菌斑再产生噬菌斑，便可大体了解样品中存在的噬菌体种类。

lxh670120

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lxh670120

请问楼主，不单单是大肠杆菌在发酵过程中会出现菌体自溶现象，其他的如枯草发酵中也出现此类现象是不是也有可能？

xiangchengmeng

感谢分享！

deitygl

lxh670120 发表于 2012-8-10 15:36
请问楼主，不单单是大肠杆菌在发酵过程中会出现菌体自溶现象，其他的如枯草发酵中也出现此类现象是不是也有 ...

那当然，噬菌体是相当厉害的，芽孢杆菌遇到也是会自溶的