甲醇酵母系统表达的影响因素

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酵母菌是单细胞真核生物，具有生长快、易于遗传操作、能对外源蛋白进行翻译后加工和修饰、不产生有毒产物等特点，被认为是表达外源蛋白的合适宿主。几种工业酵母尤其是巴氏毕赤酵母(pichia pastoris, Pp)，因具有旺盛的生长力以及其它一些独特的性质，已发展成为较成熟的蛋白生产的表达系统。已有许多细菌、真菌和高等动植物的基因在Pp中成功表达(如破伤风毒素片段Ｃ，12g/L)，但也有许多蛋白的表达量并不理想(如多瘤病毒大T抗原，0.5mg/L)，甚至不能表达(如HIV表面糖蛋白)。另外，酵母表达系统的局限性还在于分泌产物的不均一性，包括聚合体的存在、信号肽加工不完全以及内部降解等现象。所有这些都提醒我们在Pp中表达外源蛋白时，应周密考虑影响其表达的各个因素。

甲醇酵母可以在以甲醇为唯一碳源和能源的培养基中生长。这是因为其细胞中含有甲醇代谢途径的必需酶，如醇氧化酶(AOX)、二羟丙酮合成酶和过氧化氢酶等，其中AOX是甲醇酵母利用途径中的第1个酶，它催化甲醇被氧化为甲醛和过氧化氢。过氧化氢进一步由过氧化 氢酶分解成水和氧。甲醛在胞浆内被甲醛脱氢酶(FMD)和甲酸脱氢酶(FMDH)氧化成二氧化碳，或者在5一磷酸木酮糖(Xu5p)、二羟丙酮合成酶(DHAS)催化下形成3一磷酸甘油醛(GAP)和二羟丙酮 (DHAP)。DHAP与GAP在1，6-二磷酸果糖醛缩酶作用下形成1，6-磷酸果(FBP)。FBP又由1，5-二磷酸果糖酶去磷酸化生成Xu5p和GAP。Xu5p又一次参加循环，而GAP有1／3进入主代谢途径，用于合成其他物质。

在甲醇酵母中，已克隆到2个编码高度同源的AOX1、AOX2基因，其中AoX1基因是利用甲醇的第1个酶基因，它的表达是在转录水平调控的。以甲醇为碳源时，生长的细胞中约 5 的mRNA来自AOX1基因。AOX1基因的调控过程分两步：抑制机制加上诱导机制。简言之，在以葡萄糖或甘油为碳源的培养基上生长时抑制转录；而在以甲醇为唯一生长碳源时，诱导基因转录和蛋白表达。甲醇酵母在含甲醇培养基上的生长速率与野生型类似，称为甲醇利用快型(Mut )，如GS115 (his4)。当AOX1基因被其他基因取代时，则需依赖AOX2基因，AOX2与AOX1有97 的同源性，但甲醇代谢速度慢，称为甲醇利用慢型(Mut )，如KM71。当AOX基因全部缺失，不能利用甲醇时，称甲醇利用负型(Mut-)如MCIO0-3。3型菌株在A0X1基因启动子调控下均可诱导异源蛋白的表达。

甲醇酵母生长的适宜温度一般为28~30℃，诱导期间如果温度超过32℃，则不利于蛋白表达，甚至会导致细胞死亡。以甘油或葡萄糖为碳源时，Mut+和Mut5。的生长速度并无区别；而以甲醇为碳源时，Mut+比 Mut5的生长快。

所有这些都提醒我们在Pp中表达外源蛋白时，应周密考虑影响其表达的各个因素：

1、外源基因自身的影响

外源基因的特性是决定表达成败的首要因素。外源基因序列中mRNA 5端非编码区(5r-UTR)的核苷酸序列和长度影响外源基因的表达。适当长度的5’非翻译区可极大地促进mRNA有效地翻译，5-UTR太长或太短都会造成核糖体40 S亚单位识别的障碍。AOX1基因5r-UTR长为1l4nt，并富含A+U，其编码的乙醇氧化酶表达量极高，故维持外源基因mRNA 5r-UTR尽可能和AoX1 mRNA 5-UTR相似是必需的，最好是保持两者一致。

A+T含量高的基因在甲醇酵母中表达时，有时会造成转录提前终止，共有序列ATTATTTTATAAA就是一个转录提前终止信号。另外在A+T丰富区还存在一些没有确定的转录提前终止信号。因而对A+T含量丰富的基因，最好是重新设计序列，使其(A+T)含量在30％~55％范围内。这种方法使人血清白蛋白(HAS)的表达量提高50倍左右。用这种方法可使破伤风毒素C片段得到高效表达。某些稀有密码子，尤其是稀有密码子密集区往往也成为制约翻译速率的因素，所以应该使稀有密码子突变为酵母所偏爱的密码子来提高表达效率，对这些偏好密码子的使用程度和基因表达水平成正比。因此，要得到高效表达，最好对外源基因进行改造，选用甲醇酵母偏好的密码子，尽量使mRNA5’非翻译区的核苷酸序列和长度与醇氧化酶的相似。

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酵母菌对外源基因的表达也和外源基因密码子的选用有关。了解表达系统宿主在密码子使用上的偏爱性对从翻译水平分析基因表达的规律有重要意义，也可为改造外源基因或改造宿主细胞提供依据。如果外源基因密码子中存在过多的宿主低利用密码子，位于起始密码子附近 的低利用密码子对基因的表达就会产生很大影响。解决这一问题的方法有2种：一是通过点突变的方法用同义高利用率密码子替代低利用密码子而不改变氨基酸序列；另一方法是截取基因中影响其生物活性的部分。目前，这些方法在甲醇酵母表达系统中都能提高表达水平。

外源蛋白的空间构象、糖基化位点、水溶特性、氨基酸组成以及其他的理化特点都会影响毕赤酵母对其分泌，所以应根据外源蛋白自身的理化特点来选择胞内表达或分泌型表达方式。

外源基因在酵母基因组中的整合数也可以影响外源基因的表达水平，应该选用高拷贝整合来提高外源基因的表达水平。

2、表达框的染色体整合位点和方式

虽然相对于自主复制载体来讲，整合性载体的转化率较低，但由于Pp没有天然质粒，所以设计表达载体偏向于染色体整合，通过同源重组，载体整合到细胞染色体中间。整合性载体具有表达框稳定和可控制整合位点等优越性，并且能够发生多位点整合而获得多拷贝。

AOX1和组氨酸脱氢酶(histidinol dehydrogenase，HIS4)基因位点都已被成功用于表达外源蛋白。Sreekrishna等注意到his基因座的lacZ表达框偶有缺失。这种缺失源于表达框中his4染色体突变拷贝与完好的his4基因的基因转换。因此，看起来aox1位点是较为理想的位点。

3、宿主的甲基营养表型：Mut+或Muts

用末端与aox1基因5'和3'端同源的线性DNA转化Pp HIS4菌株可导致Mx1结构基因的特异性剔除。aox1基因缺失的酵母在甲醇限制性培养基上生长缓慢(methanol utilization slow , MutＳ或Mut-)，它们只能利用弱的aox2基因启动合成aox2基因启动合成AOX；而aox1基因完整的酵母则生长正常(Mut＋)。原则上，如果是胞内表达，应尽量用Mut－细胞，这样得到的蛋白产物中醇氧化酶蛋白量较少而目的蛋白量相对较多(约占Pp总分泌蛋白量的30-90%，如人乙酰胆碱酯酶B变异链的含量占到90%，使下游纯化更易进行。当诱导AOX1时，转化子不能同时高水平产生酒精氧化酶和外源蛋白，与野生型Mut＋比较，Mut－细胞对氧的要求亦较低，生长也较慢。为解决这个问题，Jeffrey等用甲醇加甘油混合饲养，得到了255mg/L的CD40配体(CD40L)。但由于甘油可部分阻遏aoxl启动子，蛋白表达可能并不处于最佳水平。Sreekrishna等最近运用山梨醇和甲醇混合批量饲养发酵，在不到4个星期的时间里，他们用一个4L的发酵罐连续完成了几个周期的生产。在这种发酵方式中，大部分碳源由山梨醇提供，减少了总的甲醇消耗，因而效率大大提高。

最近，一种无需甲醇诱导而能组成性表达外源蛋白的毕赤酵母载体pCAPZ和pGAPZa已经构建成功，组成性表达的蛋白量与该蛋白对酵母菌的毒性有关。研究发现它们常能生产比诱导型载体pPICZ和pPICZa更高的外源蛋白。这些载体均利用了编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因的启动子。Doring等分别用pGAPZB和pPICZB来生产兔肾肽转运蛋白（rPEPT2）以及人小肠肽转运蛋白(hPEPT2),结果发现，前者表达的此两种蛋白的产量均比后者高4倍。看来在生产哺乳动物膜转运蛋白时，pGAP比pAOX1更理想。

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4、基因剂量

许多实例表明，含单拷贝表达框的宿主菌足以得到最佳产量，而在大多数情况下，随着拷贝数的增加表达产物量也会相应增加。lare等的实验结果表明，重组鼠表皮生长因子(mECF)在Pp中的表达量与其基因量成正相关，而高拷贝、高表达量的宿主菌株可以通过一种快速DNA斑点杂交的筛选方式获得。不过个别情况下拷贝数增加对产量也会产生负效应，似乎表明分泌效率低的蛋白在过高表达的情况下会对分泌途径形成负反馈抑制。

因此，基因拷贝数对表达量的影响是无法预测的。高表达菌株的筛选只应以表达的蛋白量为唯一标准。Jeffrey等建立了一种双滤膜筛查方法，首先将菌落转在醋酸纤维素膜上，再与硝酸纤维素膜叠放在酵母固体培养基上，经过一段时间的培养，分泌蛋白就印在硝酸纤维素膜上。再用此蛋白的抗体检测，即可挑出最高蛋白量对应的克隆。用这种方法，每套滤膜可筛选100-1000个克隆，从而快速地从大量重组菌株中筛选出高表达克隆，并从每升发酵上清液中获得了255mg的重组cD40L。

5、分泌信号

对于一个原本就不能分泌的蛋白来说，采用分泌方式生产是非常困难甚至是不可能的。但为了下游工程处理的方便，外源蛋白的生产应尽量考虑采用分泌表达的方式。有些情况下外源蛋白自身的信号肽就足够了。如果不能利用自身信号肽，那么酿酒酵母转换酶或a配对因子(AMF)的前导序列可以非常有效地引导体积稍小的产物出胞。一般情况下，应用酵母特有的分泌信号表达外源基因获得成功的可能性大。

但酵母表达基因工程产物的另一问题是信号肽加工不完全，其表达的外源基因产物常比设计的多几个氨基酸。这可能是酵母细胞自身调节机制对外源基因高表达的应答表现。Singh等通过定向缺失诱变MFa1和干扰素基因连接处寡核甘酸导致了含有天然N端的成熟干扰素的正确释放，可以成为解决这一问题的一种好方法。

6、培养条件的影响

培养条件主要包括培养基、通气量、pH值、甲醇含量、培养时间、培养温度等。培养基主要对生物量和诱导表达有影响。在培养基中添加特殊的营养物质(如添加限制氨基酸；在表达含有金属的酶时，在培养基中添加金属元素)，能提高一些特殊蛋白的表达水平。充足的通气量对于诱导阶段外源蛋白的表达极其重要，应该保持高通气量。实验室里在三角瓶中培养时可以加人适当的缓冲液调整pH值，以保持最高程度的通气量来满足诱导表达的需要。

甲醇诱导的方式、用量、诱导时间都会影响外源蛋白的表达水平。在诱导期间每天应往培养基中补加甲醇，以弥补甲醇的消耗和蒸发；但由于培养条件和转化子表型不同，添加甲醇的量也有所不同，一般添加量为培养基体积的0.5％～1％。诱导时间过短则表达量很低，过长则外源蛋白的降解增加，应根据菌株的需要选择合适的诱导时间，一般诱导时间在150 h左右。另外，甲醇诱导表达时，培养温度不宜超过30℃。

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7、产物稳定性

酵母细胞膜上有一种KEX-2样蛋白水解酶，能专一性水解a因子前体中羧基端的肽键，即连续两个碱性氨基酸(如LySArg，LysLys，ArgArg，LsArg)，酵母基因工程表达产物发生降解现象的原因就在于此。改变培养基的PH值、加入适量的酵母提取物和蛋白胨或酪蛋白水解物，都能够提高外源蛋白的稳定性，而某些酶抑制剂如EDTA，虽然也能增加其稳定性，但却常会使一些原先并不明显的蛋白变得非常明显，影响其使用效果。

分泌蛋白的水解稳定性可通过改变培养基的pH来提高，实验 pH范围是2.8~6.5．在培养基中加入Casamino acid或YP可大大提高产物的稳定性。例如，将培养基的pH从5.2增加到6.0，HSA的分泌水平可明显提高；若在培养基中加人YP，则产量可进一步增加。加5 mnoL／L EDTA到培养基也能提高产物的稳定性。利用S cerevisiae的PEP 4基因在P pastoris中的同源区缺失菌，如SMDI168(his4，pep 4)、SMDl165(his4，prb 1)和 SMDl163(his 4，pep 4，prb 1)来提高产物的稳定性，如发酵罐中IGF-I的产量增加了约50％。而且，pep4突变菌株和野生型菌株生产的IGF-I纯化后发现，pep 4突变株培养基中的IGF-I更稳定，这就说明减步蛋白降解致使产量明显提高。

另外，使用蛋白酶缺陷株如SMD1163、SMD1165或SMD1168亦可避免产物降解的发生。虽然并不是每一种外源蛋白都会受内源性蛋白酶的影响，但在未知其有无降解可能的情况下可以考虑使用此种宿主菌。

在另外一种情况下，如果基因工程产物会影响宿主菌生长代谢活性的话，也可能出现高度降解的情况。如重组人基质金属蛋白酶3(MMP-3)被认为有促使哺乳动物上皮细胞凋亡的作用。它在Pp中高度降解，仅当与其组织抑制物TIMP-1共表达时才能保持稳定。这也提醒我们外源基因本身对产物稳定性的影响同样重要。

8、翻译后修饰

一般情况下Pp能产生较酿酒酵母明显要短的高甘露糖型寡糖链，且较均一，长度在8－14个之间，使产物更加稳定，而这正是Pp表达外源蛋白的一个优势。虽然糖基化对某些外源蛋白的活性没有太大影响，它却可能在蛋白折叠和抗蛋白酶降解中起重要作用。然而，糖基化也有其不利的一面。例如人红细胞生成素受体的胞外配体结合区(EPObp)因糖基化程度不同而呈两种状态(30X103和60X103)；人组织因子则在SDS-PAGE上以从37X103到45X103的3个条带存在。另外，聚合体的存在也会成为产物不均一的原因，这些都给基因工程产物的纯化和工业化生产带来一定困难。从药物应用的观点来看，不合适的糖基化和寡聚体可能会在机体内产生免疫反应或毒副作用，并且会明显影响纯化过程中产率的提高，因此，选用一种能够获得单体均一形式的基因工程产物十分重要。这方面的研究仍有待探索。

9、发酵新策略

通过利用甲醇以提高生物量的连续发酵方式不适合Mut菌株。Craze JA和Prevatt WD在寻找促进生长、且不阻遏AOX I基因启动子的甲醇诱导功能的碳源时发现，山梨醇和丙氨酸是两种最好的底物。最近利用山梨醇+甲醇混合培养基进行的分批发酵在Biostat-B(Braun)台式微量发酵罐中完成MMP-2生产的几个循环，4wk内生产出25 L含MMP-2的培养基。该方法对Mut+细胞同样有效，因为它减少了甲醇的总消耗量，大多数的生长靠山梨醇来支持，甲醇可在任何需要的时间点添加到山梨醇中诱导表达

巴斯德毕赤酵母表达系统不存在原核表达系统的内毒素难以除去的问题，也不存在哺乳动物细胞表达系统的病毒和支原体污染等问题，并能够对目的蛋白进行类似高等真核生物的翻译后蛋白加工，是目前最为成功的外源蛋白表达系统之一。随着对巴斯德毕赤酵母表达系统的研究的广泛深人，该表达系统也将更完善。相信在将来的理论和实践中，如在分子生物学基础研究、基因工程产品开发、生物催化剂、生物制药等诸多应用领域中也必将发挥巨大作用。

作为一种正在发展中的表达异源蛋白的宿主体，Pp酵母菌兼有原核细胞的分子遗传操作和生长特性及真核生物的翻译后修饰机制的长处。虽然目前存在的诸多困难使得仍有许多蛋白难以在这个系统中成功表达，但随着对它的利用和探索的不断深入必将不断给我们增添新的见解，使我们有理由相信会最终解决这些困难，将巴氏毕赤酵母系统不断完善。